目前，正热的转录研究能够高效揭示与精神疾病相关的基因在特定的细胞类型中如何表达。神经系统基因传递的首选方法是利用重组腺相关病毒(rAAVs)，但它们的基因组负载有限，对特定的神经元群体没有选择性，而理解和治疗这些精神疾病需要我们有针对和操纵特定神经元的方法，因此开发出新型的神经元特异性病毒至关重要。

一、序列筛选

SCN1A基因编码Nav1.1蛋白，这是一种钠通道，在三个不重叠的神经元群体中特异表达：PV cINs， VIP cINs和第5层锥体神经元。为了找出Scn1a特异表达的调控序列，Jordane Dimidschstein实验室取了靠近该基因转录起始位点的保守位点，并用scATAC-seq(single-cell assay for transposable-accessible chromatin sequencing)技术对阳性表达细胞测序（这种技术可以知道染色质上哪些区域是处于开放的状态，一般只有开放的染色质才能结合转录因子），筛选出E1~E10这10个备选增强子序列。

   二、特异性检测

为了检测候选增强子的特异性，作者将每个候选序列插入到含有红色荧光报告基因(rAAV-E[x]-dTomato)的AAV载体上，生产PHP.eB血清型的病毒，全身注射到成年小鼠体内。3周后，病毒在大脑皮层以及多个大脑区域都有很强的表达。除E5外，绝大多数病毒标记的细胞表达Gad1（泛中间神经元标记物）。不同增强子的病毒在皮质神经元中的共定位程度各不相同，从E2的>90%到E6的<5%。接下来，作者进一步研究了E2、E5和E6表达的神经元群体的位置和层次分布。与它们的层级分布一致，与各种标记的共定位分析表明，绝大多数表达dTomato细胞在E2调控元件的控制下与PV共定位。作者还发现E6对VIP中间神经元有很高的选择性。E5调控元件虽然在所有层都有稀疏的表达，但在第5层锥体神经元表达明显更强。

这些数据表明，在大脑皮层表达Scn1a的神经元群体中，很大一部分被这三种增强子的共同表达所反映，而这3种神经元互相并不重叠，因此这些病毒工具提供了一种分析神经元亚型的手段，可以用来研究特定神经元的正常功能以及病变皮层中的异常。

PV cIN神经元是一类重要的快放电的中间神经元，大约占皮层中间神经元的40%。这些神经元对局部神经网络施加很强的抑制性控制，它们的功能障碍直接与神经和精神障碍有关，包括德拉韦氏综合征、局灶性癫痫、自闭症谱系障碍和精神分裂症，因此，控制PV cIN神经元的活动对基础研究和临床应用都特别有意义。由之前的实验可知，E2调节元件对PV cIN有大约90%的特异性，所以作者将精力集中在研究E2调控元件的特性上，以开发一种具有广泛实用价值的病毒工具。全身注射rAAV-E2-dTomato的成年小鼠在1周后即可检测到病毒报告基因的表达，3周后达到较高且稳定的表达水平。免疫组织化学(IHC)和原位杂交(ISH)均显示皮质区约90%的病毒标记细胞为PV cINs。虽然病毒表达部位主要局限于皮层，但在与Scn1a表达区域密切对应的其他脑区也观察到了一些阳性细胞，比如初级视觉(V1)皮层、扣带皮质、下丘、海马CA1区和黑质网状部。重要的是，除了在肝脏(可能所有通过AAV系统传递的都会在此有表达)和肺部(Scn1a在低水平表达)中观察到少数细胞外，几乎没有观察到脑外的病毒报告基因表达。这表明，尽管经过系统递送，E2载体可以被用来选择性地靶向不同脑区的PV cINs神经元，在中枢神经系统以外的地方没有明显的非靶向表达。

许多实验范例和临床应用将需要局部注射，而不是全身注射。与全身注射相比，立体定位注射通常会导致每个细胞产生更多的病毒颗粒，这可能会导致非靶向表达，要在这些情况下发挥作用，病毒表达必须保持对PV   cINs的高度特异性。为了测试增加病毒载量是否改变了特异性，作者在成年小鼠的皮层局部注射了不同滴度的等量rAAV-E2-dTomato，并在一周后检测了报告基因在PV   cINs中的表达。结果表明，虽然较高的滴度增加了报告基因的表达水平，但没有观察到特异性的改变。

在小鼠上，因为PV神经元的出现是在P15之后，也就是出生后15天，所以这个启动子在该时间后可以用。不过即使在P0用该启动子，也可以做到对快放电神经元标记特异性大于50%，之后随着时间延长特异性增强。经测试，这个启动子还可以用在猴子和人的细胞上。

三、S5E2启动子引导其他基因的表达

在证明了不同注射方式和不同发育阶段的PV cINs，E2启动子引导的定向表达的保真度后，作者随后探索了该载体在研究连通性(突触前报告)和活性(钙成像)方面的应用。当E2被用来驱动SYP（突触素）-tdTomato融合基因时，报告基因的表达在突触前被限制在PV cINs上，末端沿异构体定位在锥体神经元上。当这个载体被用来驱动GCaMP6f表达时，钙信号的变化与触须刺激的时间相符。综上所述，这些结果表明，E2为监测PV cIN生物学的各个方面提供了一种有效的手段。

接下来，作者使用化学或光遗传学方法检查E2是否足以引起活动的功能变化。在成年动物中使用E2来引导PSAM4-5HT3-LC的表达。从这些动物收集的大脑切片中的PV cINs，PSAM4-5HT3-LC被Varenicline激活后，当电流控制在阈值以下时，可以被诱导发射。使用GQ-DREADD也得到了类似的结果。最后，在脑片中表达视蛋白C1V1，持续和高频激光刺激PV cINs，光刺激和神经元放电时间相符，证明这些神经元的接触导致局部抑制，病毒标记的PV cINs附近的锥体神经元活动被持续激光刺激中断。

在证明了这种方法在体外的有效性后，作者接下来探索通过光遗传刺激PV cIN改变体内神经网络的状态；在将rAAV-E2-C1V1局部注射到成年动物的V1皮层，3周后，对基线和激光刺激下都进行了感染区域内的记录。根据记录到的神经元的棘波宽度和最大放电频率来区分它们的同一性。不出意外，激光刺激提高了抑制性神经元间放电的频率，而抑制了兴奋性神经元的放电。

综上所述，这些数据表明，E2增强子能够在功能上与PV   cIN结合，并通过体外和体内的化学或光遗传方法引起神经网络功能的变化。

参考文献：Vormstein-Schneider, D., Lin, J.D., Pelkey, K.A. et al. Viral manipulation of functionally distinct interneurons in mice, non-human primates and humans. Nat Neurosci (2020).


特异性如此强的病毒

你有没有心动❥(^_-)

插播一条广告福利

Taitool现已推出E2增强子病毒

如有订购需要，请联系所在地区销售工程师