泰儿图新闻

20,6, 2018

泰新品 | dLight1精准点亮多巴胺,神经环路研究的探针时代降临?



(本文由泰威青研院约稿并提供奖金支持,如需转载请与青研院联系,若有意加入青研院或参与投稿,请在微信公众号留言。)



最近神经环路的探针工具层出不穷,泰儿图研发中心加班加点打造新武器,上一期泰新品我们带来了一种谷氨酸探针iGluSnFr谷氨酸传感器,这一次我们带来了一款检测多巴胺的新工具——dLight 1系统。




我们都知道神经递质系统对脑功能具有极大的影响,比如脑内五羟色胺含量下降有可能会引起抑郁症的发生,多巴胺的分泌与奖赏机制有相关性。脑内不同类型的神经元可以通过投射至不同脑区来影响动物的行为,就如脑内的多巴胺系统,通过投射至纹状体以及皮层来影响动物学习能力、选择执行能力以及运动控制能力。当多巴胺的含量减少,或者多巴胺系统紊乱时,便会造成动物的各种与多巴胺相关的疾病,诸如老年痴呆症、精神分裂症以及成瘾[1-3]。现如今很大一部分行为学相关研究都聚焦在神经元的放电模式上,但是很少有研究会关注在这些神经元释放的递质会对神经环路上神经元的变化产生影响[4, 5]。如今需要了解这些复杂的神经递质系统如何影响大脑的功能,首先得通过多种手段检测这些递质含量的变化情况。


目前检测递质最常见的方式是用微透析和微型电化学传感器来进行,但是其在时间以及空间分辨率上有明显的缺陷,而且也不能直接用来测量我们感兴趣的细胞。比如通过基于光学闭合的CNiFERs系统[6]或者基于报告基因的iTango方法[7]都能非常特异的反应出多巴胺的释放情况,但是这两个系统共同的问题是它们都不能实时的反应出多巴胺的真实释放情况,这是我们在瞬时空间中研究多巴胺释放量的巨大阻碍。





最近几年非常火爆的实时记录技术之一是用基于荧光变化下,通过记录钙信号的变化来反应神经元的变化以及谷氨酸的实时的变化[8, 9]。今年五月份来自加州大学戴维斯分校的Lin Tian 研究团队基于荧光变化开发出了dopamine-sensors的dLight1系统,该系统可以在活动动物体内以超高分辨率实时的反映出多巴胺的含量变化[10]。




在dLight1的sensor系统中,Lin Tian 研究团队直接将人类多巴胺受体中DA-binding介导的构象变化与循环摄动的荧光强度变化相结合,具体来说就是在GCaMP6蛋白的基础上做结构修饰,将人类多巴胺受体(D1,D2,D4)上的第三个内环替换成环状GFP(如图1A)。这样复杂的修饰也使得dLight1具有较高的灵敏度(100nM)。






图1:随后他们在人类胚胎细胞中证明其最大的激发波长在516nm-920nm之间,通过dLight1系统,研究人员能在培养的海马切片中区分其DA受体的树突以及单个树突棘在亚微摩尔上的变化。

当然根据同样的原理,作者还运用了dLight1系统通过类似的结构修饰换上五羟色胺或者褪黑素原件,这样也可以检测五羟色胺以及褪黑素的含量变化。


接下来作者用动物体内和体外实验来证明dLight1系统可以检测出时效性和因为刺激诱导而发生的多巴胺释放的变化,两者均能在双光子下观测到(论文原图2A)。在体外实验中首先将新开发出来的病毒系统:AAV9.hSynapsin1.dLight1.2,用立体定位的方式直接注射至纹状体中,待病毒表达2-4周之后,于电生理状态下在纹状体的切片中用电刺激和药物诱发的多巴胺变化,均能在双光子下检测出其荧光值的变化,从而进一步反应出其谷氨酸释放的变化(论文原图2B-C)。





图2:接下来作者想通过dLight1系统检测活动动物中的由刺激诱发的多巴胺释放的变化。同时我们也知道伏隔核(nucleus accumbens,NAc)能大量接受来自腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)的多巴胺能神经元的投射,具体来说就是用立体定位的方式将(1)AAV9.hSynapsin1.dLight1.2直接注射至NAc,(2)把光遗传病毒(AAV5.hSynapsin1.flex. ChrimsonR.tdTomato)注射至VTA中,而后把记录光纤埋置在NAc中,同时将光遗传刺激系统埋置在VTA中,[这样就了可以通过光遗传学刺激VTA神经元影响其投射至NAc中多巴胺释放的变化的目的,而结果也表明,确实可以用dLight1系统检测在兴奋VTA中多巴胺神经元后激活NAc中多巴胺的释放,当然作者也验证了在抑制系统中也同样工作](这样就可以用光遗传学来兴奋VTA中的多巴胺neuron, 从而引起NAc 中多巴胺的释放量增加,这个变化可以用dLight1系统精准的检测出来。而同时,如果抑制VTA中的DA的活性便会引起NAc DA的释放减少,也能通过dLight1检测到。)





图3:接下来作者也通过dLight1系统并结合光纤记录系统一起证明了在经典条件性恐惧实验中也能实时的检测出NAc中多巴胺的含量变化,[从而实现了用光纤记录系统在活动动物中由外界cue相结合小鼠的学习时相关核团中多巴胺的含量变化(如图4A)]。在活动动物中,可以在特异性相关刺激条件下引起脑内多巴胺含量的变化,该变化可以通过当下最火的光纤记录系统测量出来。






图4:综上,作者通过dLight1系统结合光纤记录系统可以非常灵敏的记录活动动物中相关核团在特定刺激下诱发的多巴胺释放量的变化。实现了快速精准的检测动物脑中多巴胺的变化。


展望:Lin Tian团队开发的Dlight1系统可以突破传统探针检测多巴胺中遇到的障碍,因为Dlight1系统可以快速检测活动动物中瞬时多巴胺的变化情况(10ms-100ms)。研究者在研究神经环路的时候如果没有快速有效的策略来检测突触前后的相关递质的变化,很多现象将无法观察到,同时相对应的很多机制也很难解释这些情况。而利用钙成像技术结合光遗传学技术,我们可以非常直接的理解在特定事件中引起的多巴胺递质释放是如何在神经元之间的信号中进行精准编码的。类似于Dlight1系统,也许在不久的将来可以继续开发出基于五羟色胺(serotonin)、去甲腺肾上腺素(norepinephrine)、褪黑素(melatonin)等作用于探针的钙信号成像的系统,为我们研究相应神经环路递质释放提供更快速、更精准的强有力工具。


新的工具将带来新的技术突破,技术瓶颈的打通将带来一系列的新研究和新发现,泰儿图已经为大家打造好多种神兵利器,热切期待这个神经科学研究百花齐放的盛世降临!





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载体结构:

AAV2/9-hSyn-dLight1.1-WPRE-SV40pA

血清型:

AAV2/9型





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注:无论阳性结果还是阴性结果,只要是客观的结果就有奖金,奖金额度仅与实验设计严谨性和数据质量相关,取得全额奖金另有神秘大奖相赠。







参考文献:

1. Tritsch, N.X. and B.L. Sabatini, Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron, 2012. 76(1): p. 33-50.

2. Wise, R.A., Dopamine, learning and motivation. Nat Rev Neurosci, 2004. 5(6): p. 483-94.

3. Dudman, J.T. and J.W. Krakauer, The basal ganglia: from motor commands to the control of vigor. Curr Opin Neurobiol, 2016. 37: p. 158-166.

4. Howe, M.W. and D.A. Dombeck, Rapid signalling in distinct dopaminergic axons during locomotion and reward. Nature, 2016. 535(7613): p. 505-10.

5. Cui, G., et al., Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature, 2013. 494(7436): p. 238-42.

6. Lee, D., et al., Temporally precise labeling and control of neuromodulatory circuits in the mammalian brain. Nat Methods, 2017. 14(5): p. 495-503.

7. Ford, C.P., P.E. Phillips, and J.T. Williams, The time course of dopamine transmission in the ventral tegmental area. J Neurosci, 2009. 29(42): p. 13344-52.

8. Chen, T.W., et al., Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature, 2013. 499(7458): p. 295-300.

9. Marvin, J.S., et al., An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods, 2013. 10(2): p. 162-70.

10. Patriarchi, T. and J.R. Cho, Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. 2018.




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