常见技术问题答疑

26,6, 2018

免疫组化观察病毒表达

一般AAV在质粒构件设计时均含有荧光报告基因,如EGFP,EYFP,mCherry等,对于感染表达效率足够高的病毒,我们可以直接切片在荧光显微镜下观察。


信息来源:BioTek,http://www.biotek.com

更多信息参考:https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorophore


当效率不够高时,需要进一步染色放大,GFP家族(包括GFP,EGFP,YFP,EYFP与mCitrine)可以使用anti-GFP抗体(Catalog#: A-11120或者A-11122,invirogen),mCherry与tdTomato可以使用DsRed 抗体(Catalog#: 632496,Clontech)。


染色基本步骤

1. 0.01 M PBS缓冲液中;5min*2次;

2. 1% normal serum孵育1h(根据二抗种属选择血清,用0.3% PBST稀释);

3. 在稀释好的一抗中孵育4℃ 过夜(稀释一抗用PBST,可加入1% normal serum);

4. PBS 洗10min*6次;

5. 二抗室温下孵育1-2h(稀释二抗用PBS);

6. 0.01M PBS 洗5min*3次。


DAPI染色

目的:

1. 显示脑片结构,明确病毒感染范围;

2. 确定细胞核位置,明确病毒在细胞定位表达在细胞核内,胞质或者细胞膜上。


一般按照1:1000-1:50000用PBS稀释,可以加入二抗孵育液,也可以在完成目标蛋白染色后加入DAPI染色。


DAPI为4’,6二脒基-2-苯吲哚(4’,6—diamidino-2—phenylindole)能与双链DNA小槽,特别是AT碱基结合,也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时,荧光强度增强20倍,而与单链DNA结合则无荧光增强现象,因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低,但荧光稳定性优于Hoechst;其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide,EB)和碘化丙啶(propidium iodide,P1)高。DAPI不能通过活细胞膜,多直接用于固定细胞或组织的细胞核染色。DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360nm和460nm。


021-59923117

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