光遗传学载体

26,6, 2018

光遗传学抑制工具比较

参考Mattis Nature Methods (2012)


1. 分类 


第一类:野生型NpHR以及基因改造的eNpHR3.0,他们均为黄光激活的氯离子泵,属于halorhodopsin家族。NpHR是从一种嗜盐古细菌Natronomonaspharaonis上分离出来的光驱动内向氯泵,其分子结构与ChR2类似,包含一个7次跨膜螺旋结构.NpHR的光活化光谱为525~650nm(中心波长为578nm)。表达NpHR的哺乳动物细胞在该波段光照射下启动氯泵,胞内氯离子浓度增高产生超极化反应。由于ChR2和NpHR的光活化谱较少重叠,这两种蛋白质被联合用于双向控制神经活动;


第二类:野生型Arch, ArchT, eBR, Mac以及基因改造的eArch3.0, eArchT3.0和eMac3.0,他们均为黄光激活的外向氢离子泵,属于bacteriorhodopsin家族。Arch是来自红皮嗜盐菌Halorubrum sodomense,ArchT来自红皮嗜盐菌Halorubrum strain TP009,eBR来自嗜盐杆菌Halobacterium,Mac来自小球腔霉菌Leptosphaeria maculans;

ArchT的激发波长主要在610-650nm,而Mac的激发波长较短(蓝移),450-490nm,为了获得较强的穿透效果,并且结合ChR2(470 nm)做到双向控制,一般都采用更长波长的ArchT。


第三类:经过改造红移的Jaws,氯离子泵,属于cruxhalordoposin家族,Jaws来自Haloarcula (Halobacterium) salinarum (strain Shark),经过改造后激活波长更长,甚至可以使用非侵入式给光抑制目标脑区。




第四类:自然存在的阴离子光敏感通道,anion channel rhodopsins(ACRs)。科研人员发现在隐芽藻类(cryptophyte algae)中存在一种光敏感通道,激活后特异性通过阴离子(主要是氯离子),这种工具大大提高了离子通过的效率,也提高了精确控制能力,所以只要较弱的激活的光强就能迅速达到很强的抑制效果。


第五类:改造的钾离子通道,Blue-light-induced K+ channel1(BLINK1),通过将植物LOV2-Ja光敏感元件与Kcv钾离子通道组合,我们得到了蓝光可以激活的钾离子通道的工具。因为细胞内钾离子浓度高,BLINK1的激活会使钾离子按电化学梯度外向流动,知道达到电化学梯度的平衡。

其他改造得到的工具:SwiChR, iC1C2等。 


2. 光电流分析:


       将不同光遗传抑制工具包装到的使用CaMKIIα启动子,融合EYFP荧光基因的慢病毒中,再感染离体培养的海马锥体神经元。通过直接记录被感染的神经元比较不同光遗传抑制工具的性质。 





结果发现,经过改造后的抑制工具光引起的电流更大,所以现在我们主要使用的都是第三代改造产品,eNpHR3.0eArch3.0或者是eArchT3.0。其中,eArch3.0eArchT3.0引起的光电流比eNpHR3.0更大。




激活光谱:

       eNpHR3.0的激发波长大约在560-590 nm,其他三种工具大约在520-560 nm,所以在和ChR2一起使用时,eNpHR3.0与ChR2的最适激发波长范围重叠最小,最适合同时使用。





给光开启与撤光关闭动力学参数(ton, toff

       使用1秒给光模式,精确分析给光与撤光电流变化快慢,结果发现所有的抑制工具得给光开启动力学参数ton都很小,说明打开很快;另一方面,Mac的撤光关闭动力学参数比较大,说明通道关闭较慢。 




. 通过急性分离脑片电生理检测光抑制动作电位:


       将目的工具包装到CaMKIIα启动子,融合EYFP荧光基因的腺相关病毒中,定位注射到小鼠脑内的medial prefrontal cortex(mPFC)。


观察注射位点及下游投射脑区荧光:

       由于信号上膜,所以注射位点看到的是整体荧光下很多细胞空洞的现象,而下游看到的是很多荧光纤维。eArchT3.0对应的荧光明显更强(注射位点与下游脑区)。





电流强度:

       与培养细胞的结果一致,同样条件下,eArchT3.0引起的电流更大,引起的细胞膜电位超极化更显著。





抑制动作电位:

       两种工具都能显著抑制动作电位。 





4. 比较eNpHR3.0eArchT3.0:

 

1)eNpHR3.0的激发波长比ArchT3.0更长;

2)同等光照强度下,ArchT3.0的光电流更大;

3)同等光照强度下,ArchT3.0引起的膜电位超极化更多;

4)eNpHR3.0是内向氯离子泵,而ArchT3.0是外向质子泵;

 

通常,我们推荐使用eNpHR3.0,原因是:

1)eNpHR3.0是内向氯离子泵,激活只影响细胞内氯离子浓度,不影响pH值,而ArchT3.0是内向质子泵,会显著减低细胞内的pH值;

2)科研人员认为eNpHR3.0对神经元的轴突末梢抑制效果比较好,而ArchT3.0对细胞胞体的抑制比较好;



5. Jaws:

       Jaws是经过改造红移的氯离子泵,它最大的特点是在632 nm光照下,引起的超极化电流比eHpHR3.0或者ArchT显著大,所以它的应用主要是在使用红外激光抑制目标位点,甚至可以使用非侵入式给光方式抑制Jaws感染的位点。





6. SwiChR, iC1C2:

       iC1C2是经过改造的氯离子通道工具。C1V1是部分ChR1部分ChR2组成杂合体,在蓝色光照下,原本通过阳离子,而经过对离子通道的随机突变检测,一种九位点联合突变的亚型具有特异的氯离子内流的能力,被称为iC1V1。在HEK293细胞中表达发现它的反转电位在-61 mV,而细胞要爆发动作电位需要从-70~-60 mV去极化至- 55 mV,所以在蓝光激活情况下,可以使细胞抑制动作电位的发生。另外,研究发现,当同时改变胞内与胞外pH值时,从生理状态的7.3降为6.0,iC1V1的发转电位可以进一步降低,说明这种工具在低pH时更容易发挥作用。

       实验表明,无论时持续注入电流或者脉冲电流诱导动作电位都可以被抑制,而且这种抑制相对比较生理,因为它的反转电位就在-61 mV附近,可以成功抑制动作电位,但不会引起细胞膜电位剧烈的变化,可以比较NpHR和Arch激活时显著降低细胞膜电位。





通过进一步对iC1V1进一步的改造,研究发现对167半胱氨酸进行突变可以减缓通道的关闭从而达到一次光照持续激活的目的。其中C167T(SwiChRCT)或者C167A(SwiChRCA)比较理想。SwiChRCT的反转电位约在-61 mV,而SwiChRCA的反转电位约在-68 mV,两者都可以被单次蓝光持续激活氯离子通道,使细胞持续保持抑制状态,并在红光照射后关闭氯离子通道。

       这种工具适合单次给光,可以将长时间将细胞膜电位维持在生理静息水平,不爆发动作电位,有利于实验者进行在体研究较长时程生理反应过程。 



021-59923117

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