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20,6, 2018

泰新品 | 网红载体mDlx上市,标记GABA能中间神经元



最近真是高产的季节,泰儿图又上新了!

本期闪耀新星 mDlx 强子 , 这项来自J Dimidschstein等人的研究讲述了其在中间神经元实验中的表现,希望能为各位提供一些方法学上的借鉴。话不多说,让我一起来看看泰威青研院泰小风的解读:



Ps

文章分析非常详细,没时间细看? 一键拉至文末看干货总结




今天人们研究大脑的过程中存在一些基础性阻碍,其中之一就是需要找到一种具有可操作性的、可以靶向和操纵特定神经元类群的经济又可靠的方法,如何克服这种障碍是亟待解决的一个难题。因为在解剖、生理、认知和行为表现上,实验动物之间存在相当大的差异,而高等哺乳动物的特殊功能细胞类型很难特异性定位与操纵。于是在这个背景下,J Dimidschstein等人[1]开发了一种新型AAV病毒载体,它能限制基因表达到端脑内的GABA能中间神经元。这种病毒的表达,强效又具有特异性,可以实现形态学可视化,活动监测和操纵小鼠等多种物种的中间神经元,这无疑拿到了一把可以开启“研究几乎任何脊椎动物的GABA能细胞功能”的金钥匙。





mDlx研究历史


GABA能的抑制性中间神经元虽然在数量上少于谷氨酸能神经元,但是它能在所有中央处理中扮演关键角色,他们的功能失调会引起很多精神疾病。


而目前,虽然一些兴奋性细胞和胶质细胞都已可以成功定位,但目前尚缺乏针对抑制性中间神经元的有效方法。针对中间神经元的特异性基因操作,仍只能通过转基因小鼠来实现。作为一种常用的基因传递方法,AAV 中包含DNA顺式调控元件如特定的启动子或增强子,能够使表达限定于目标细胞中。但是由于它的自身局限性,这些元件与AAV能包装的大小并不能相容。除去最小的报告基因EGFP or dTomato以及功能元件,如ChR2 or DREADD,只有不到2kb的空间留给顺式调控元件。


为了找到能够限制表达在特定细胞类群的小元件,他们检查了中间神经元的调控因子,并发现distalless homeobox 5 and 6 (Dlx5/6)基因特定表达在胚胎发育阶段的前脑的GABA能中间神经元中,他们相对于彼此,具有相反的方向,并且在3’端的10kb非编码区域共享400 bp (mI56i or mDlx) 和 300 bp (mI56ii)的增强子。此外,这些序列在脊椎动物中是高度保守的,这暗示着他们起到重要的功能。




在体外,mDlx增强子限制报告基因表达在GABA能中间神经元


在培养的小鼠初级皮层神经元中表达rAAV-mDlx-GCaMP6f载体11天后,进行GFP和Gad67免疫染色,获得95%的共标率。在体外钙成像实验中,通过自发的钙信号变化,能监测到细胞活动。

以上结果证明在体外系统中,结合GCaMP6f的mDlx增强子能够限制基因在中间神经元中的表达并监测后者的相关活动






在体内,mDlx增强子限制报告基因在前脑的GABA能中间神经元中表达


在Dlx6aCre:Ai9小鼠的皮层和海马中注射rAAV-mDlx-GFP,多数表达GFP的细胞都带有红色荧光。 在纹状体中注射rAAV-mDlx-GFP后,也与中间神经元marker Nkx2.1共标。

之后,为了检测mDlx增强子能否驱动基因表达在非Dlx5/6谱系下的中间神经元中。

在p0小鼠的腰部脊髓处注射rAAV-mDlx-GFP,7天后检测病毒表达。GFP几乎只表达在腰椎的背角部分。但是与Pax2不共标,不论是在胚胎还是成年动物中,Pax2几乎是一个能在脊髓背角表达所有GABA能和甘氨酸能的中间神经元中的一个maker。

以上结果表明,用rAAV-mDlx-GFP感染成年老鼠,能特异表达在端脑的Dlx5/6谱系下的GABA能的中间神经元中。




rAAV-mDlx-Flex-GFP允许中间神经元的交叉定位


目前,对中间神经元特定亚型的精准定位和操纵依然局限在使用同时表达cre和Flp的转基因老鼠中。研究人员想知道对中间神经元特异的rAAV-Dlx能否在只表达cre的小鼠中实现交叉定位。

他们在Cck-Cre小鼠中注射rAAV-mDlx-Flex-GFP。虽然Cck在中间神经元的特定亚型中表达,但是它在谷氨酸能神经元中的广泛表达限制了Cck-Cre小鼠在定位中间神经元的应用。在S1和CA1区域,多数表达GFP的细胞同时也与Gad67共标。

这些数据表明,mDlx增强子限制了cre依赖型的报告基因只表达在中间神经元中。故其可以被用于简化的交叉定位中。


为了测试cre重组酶本身是否能通过这种方法进行选择性的定位,他们在RCE-loxP的转基因小鼠中注射了在mDlx增强子控制下,表达核内Tdt和cre或不稳定cre的病毒(rAAV-mDlx-Cre or rAAV-mDlx-dCre)。虽然Tdt只表达在中间神经元中,但是在病毒注射位点,几乎所有细胞都表达了GFP。(结果文章并未展示)

以上说明,微量的cre重组酶足够驱动cre依赖型基因的表达,同时也表明了这种方式不能实现重组酶的特异表达。





rAAV-hDLX-Gq-DREADD 允许化学遗传操纵中间神经元的活动


为了检测能否使用rAAV-hDlx获得化学遗传操纵能力,他们做了一个带有HA tag的rAAV-hDlx-Gq来表达核内红色荧光。

首先要检测人源的Dlx5/6增强子对病毒的特异性定位有没有影响。他们在Dlx6aCre::RCE小鼠的S1和CA1区注射rAAV-hDlx-Gq。结果显示,多数表达Gq的细胞也表达GFP。另外,Gq-DREADD在膜上的表达也符合预期。

之后,他们测试了这些细胞内Gq-DREADD的功能。浴液中给CNO少于1min,表达Gq-DREADD的中间神经元都表现出去极化的膜电位。

最后,在表达Gq-DREADD的中间神经元附近,用电压钳记录锥体细胞,在CNO之后,抑制性突触的电流明显增加(iPSC)。

这些实验表明rAAV-mDlx-Gq可以使Gq-DREADD限定在特定细胞类群中表达,且CNO能有效且选择性的增加了中间神经元的活动,同时使对相邻的兴奋性神经元的抑制性效果显著上升。






rAAV-mDlx在多种脊椎动物物种中的GABA能中间神经元内选择性表达


mDlx增强子序列在脊椎动物中的高度保守性,表明它在Dlx5/6基因的转录调控中起到稳定的作用。

研究人员想测试rAAV-Dlx是否能在非转基因动物中将不同的报告基因和效应分子特定的表达在中间神经元中。

与小鼠中的结果相同,他们在斑马雀,雪貂,沙鼠和狨猴体内通过rAAV-Dlx表达GFP或RFP,能与GABA或Gad67免疫染色共标。而在人类中,他们用rAAV-mDlx-GFP感染取自病人的IPSC,发现多数表达GFP的细胞也表达GABA。为了确认上述结果,他们将rAAV-hDlx-dTomato导入dorsalized hESC(主要为谷氨酸能神经元)和一个在由内侧神经节隆起驱动的中间神经元特异表达Citrine的转基因hESC(hESCLhx6-Citrine)中。结果显示多数核内表达Tdt的细胞也表达Citrine,dorsalized hESC中没有表达Tdt。

这些结果表明 Dlx 增强子在几种测试的脊椎动物中能够限定rAAV在中间神经元中表达,包括在人体中亦然。这种方法的成功进一步强调了rAAV-Dlx在非转基因动物模型中识别中间神经元亚型的潜力。











我们简单总结一下以往常用的识别和操纵GABA能神经元策略:

1. 利用cre重组酶驱动结合报告基因或AAV病毒可标记GABA能细胞[2]。但是单一的基因和单一的细胞类型可能并不是特别匹配,多数情况下是单一基因下标记多个细胞类群。

2. 利用cre,Flp或其他重组酶的交叉策略,提高细胞定位的精确度,共标及非共标的细胞类群;不止细胞类型,甚至能区分不同的脑区[3,4,5,6]。但是现有的多重组合还是很有限的。

3. 转录因子通常只在祖细胞中起作用,在成熟的神经元中会减少表达甚至改变表达模式,为了研究它们,通常会给他们加一个永久性的genetic handle(e.g., Flp, tTA),通过他们的子代神经元研究[7]。

4. 利用现有的能定位GABA能神经元的转基因小鼠,做这些细胞的基因的表达谱,有可能定位其中更少的细胞类型,为更具体的定位提供一定的可能。


相比之下,这项研究的意义就非常突出了:

1. 突破了在非转基因动物中不能精确识别和操纵特定神经元类型的限制。

2. AAV装载容量很有限(~4.7kb),只能通过短小的顺势调控序列限制在特定的细胞中表达。而增强子是包含转录因子结合位点的顺式作用元件,其负责基因表达的组织特异性转录调控。

3. Mouse Dlx5/6增强子是高度保守的,与多物种相似度高,可被广泛应用于中间神经元的基因表达,增进人们对中间神经元的理解。

4. 针对Dlx增强子是如何作用的,他们提供了一个有效的工具,可用来研究多种物种的海马,皮层和纹状体的抑制性GABA功能,甚至在临床研究中都具有有较强的潜在效用。

5. 随着高通量测序的发展,我们也许可以寻找其他保守的增强子,开发新的病毒工具,那些前所未有的具有特异性靶向和操纵特定功能的细胞类群。



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参考文献

[1] Dimidschstein J, Chen Q, Tremblay R, et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate secies[J]. Nature neuroscience, 2016, 19(12): 1743.

[2] Taniguchi, H., He, M., Wu, P., Kim, S., Paik, R., Sugino, K., Kvitsiani, D., Fu, Y., Lu, J., Lin, Y., et al. (2011). A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron 71, 995–1013.

[3] Dymecki, S.M., and Kim, J.C. (2007). Molecular neuroanatomy’s ‘‘Three Gs’’: a primer. Neuron 54, 17–34.

[4] Dymecki, S.M., Ray, R.S., and Kim, J.C. (2010). Mapping cell fate and function using recombinase-based intersectional strategies. Methods Enzymol. 477, 183–213.

[5] Fenno L E, Mattis J, Ramakrishnan C, et al. Targeting cells with single vectors using multiple-feature Boolean logic[J]. Nature methods, 2014, 11(7): 763.

[6] Madisen L, Garner A R, Shimaoka D, et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance[J]. Neuron, 2015, 85(5): 942-958.

[7] He M, Tucciarone J, Lee S H, et al. Strategies and tools for combinatorial targeting of GABAergic neurons in mouse cerebral cortex[J]. Neuron, 2016, 91(6): 1228-1243.





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