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AAV受体研究进展

参考文献:

1. In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors, Current Opinion in Virology, 2016,

2. An essential receptor for adeno-associated virus infection, nature, 2016,


       腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)早在1965年被发现已经得到广泛的应用,不仅出现了多种血清型亚型,也出现了很多经过修改具有特异顺逆行感染能力的亚型,不仅在基础科研领域AAV的重要性与日俱增,在人类临床试验中AAV也展现了它的重要性。

       但是,AAV能够感染细胞的分子机制到底是什么之前并没有确凿的研究,如果能找到AAV的感染机制也许就能解释不同亚型对不同系统的感染效率不同的现象。


发展历史


       在1996年,Mizukami发现一个150 kDa的膜蛋白可以与AAV2结合,推测它可能是AAV2的受体,但是之后并没有更多报道。在1998年,Summerford和Samulski发现硫酸类肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)可能是AAV2 的受体,因为HSPG在各类物种的各种细胞中都有广泛表达,所以这也解释了AAV2对各个系统的感染能力均较强。但是后来研究发现只有HSPG并不足够使AAV2感染进入细胞,AAV2缺失HSPG结合位点也能感染组织。在1999年,Qing发现的人成纤维细胞生长因子1受体(human fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)与Summerfold发现的αVβ5可以作为AAV2的共同受体(co-receptor)。现在,除了FGFR1,αVβ5外,至少还有四中共同受体,包括:肝实质细胞生长因子(hepatocyte growth factor receptor),α5β1整合素,层连蛋白受体(laminin receptor)和CD9。


不同血清型可能使用不同的受体: 


       到现在,大约发现了13种不同的血清型(AAV1-AVAV13)。大家公认病毒颗粒粘附在细胞表面是成功感染的第一步,而这种粘附依靠的是细胞膜上的多聚糖(glycan),所以可以将多聚糖认为病毒的最初受体。经过对23种不同多聚糖的研究可以将AAV血清型分为三大类:第一类是使用HSPG的AAV2、AAV3、AAV6、AAV13;第二类是使用唾液酸(sialic acid, SIA)的AAV1、AAV4、AAV5、AAV6;第三类是使用半乳糖(galactose)的AAV9。

       研究人员推测在经过与多聚糖结合粘附在细胞表面后,病毒还需要共同受体协助进入细胞。AAV2可能需要FGFR1,αVβ5,α5β1,HGFR,层连蛋白受体,AAV3需要FGFR1,HGFR和层连蛋白受体,AAV5需要血小板源性生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)AAV6需要上皮细胞生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR),AAV8和AAV9需要层连蛋白受体。

       病毒经过粘附,第二级共同受体作用,再经过内体通路内吞(internalized through endosomal pathways),这包括了三种机制,分别是:网格蛋白包被囊泡(clathrin-coated vesicles),网格蛋白非依赖转运体(clathrin-inde- pendent carriers,CLIC)和GPI-anchored-protein-enriched endosomal compartments(GEEC)。


AAVR的发现: 


       在2016年,通过在人类单倍体细胞系的基因组范围随机插入突变,再使用带有荧光元件的AAV2进行感染,通过荧光细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)筛选,找到了若干影响AAV2感染的位点,其中有最显著的一个基因就是KIAA0319L,他们称为AAVR。

图1展示了筛选得到的相关基因,其中KIAA0319L的突变显示了AAV2感染能力的下降。


       进一步对AAVR进行细致的分析,发现它的胞外端主要由5个免疫球蛋白样(immunoglobulin-like,Ig-like)结构域构成,也称为多囊性肾病(polycystic kidney disease,PKD)结构域。而已知这种结构域参与细胞间相互作用,组成多种病毒受体,包括脊髓灰质炎病毒,麻疹病毒和呼吸道肠道病毒。为了证明PKD结构域的确在AAV2感染中发挥重要作用,研究人员选择性的敲除PKD的不同Ig-like结构域,发现只有在敲除1-2以及2-3结构域时,会显著降低AAV2的感染效率。在敲除AAVR的细胞中重新表达1-3结构域也可以一定程度恢复AAV2的感染效率。两方面结合说明AAVR的PKD中1-3Ig-like结构域是介导AAV2感染细胞的关键结构。

       图2a展示了AAVR的结构示意图,以及分别敲除不同片段的示意图,b显示了敲除不同片段对AAV2感染能力的影响。


       AVR不仅在AAV2的感染过程中起到关键作用,同时也在其他血清型AAV病毒中起到关键作用。尽管AAV1,2,3B,5,6,8和9不同血清型使用的多聚糖粘附方式不同,但是对AAVR敲除的细胞的感染能力都显著下降。而腺病毒adeonovirus 5对AAVR敲除的细胞感染能力不变,说明AAVR的确是腺相关病毒(AAV)的受体,不影响腺病毒(AV)感染。

图3展示了AAVR敲除的细胞对不同血清型AAV的抗感染能力。


       研究人员再进一步制作了AAVR敲除的转基因小鼠,腹腔注射AAV9-luciferase,通过在体成像的方法在整体敲除AAVR的小鼠中检测不到荧光,而野生型或者敲除杂合子小鼠的腹部都有显著的荧光信号。这说明,AAVR在体情况下与体外结果一致,的确是腺相关病毒感染细胞的关键受体。

        图4展示了通过生物发光成像的方法证明在体情况敲除AAVR使AAV对小鼠感染能力下降。


       综上所述,现阶段的结论是,AAV首先通过与多聚糖作用粘附在细胞膜附近,再通过与共同受体以及AAVR的相互作用引起内吞作用进入细胞。