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基因编辑 Cas9

AAV-Cas9

  实验原理

  泰冷二代使用新的CRISPR-Cas9技术进行基因敲除,该技术系统包括Cas9稳转细胞株和gRNA表达慢病毒,Cas9稳转细胞株与野生型细胞的性状一致,当gRNA慢病毒感染后,gRNA所靶向的目的基因被敲除。通过将质粒Cas9转染筛选稳定株,使得Cas9能够得到强启动子CAG的启动,在绝大多数细胞中获得优的表达。另一方面Cas9从慢病毒上分离可以使得慢病毒需要包装的片段长度大为降低,从而保证了该系统中携带表达gRNA的慢病毒具有较好的滴度。gRNA慢病毒(同时携带Puromycin抗性基因)感染细胞后,通过Puromycin筛选可以使得〉99%的细胞表达gRNA。gRNA和Cas9共同表达后,会持续对靶基因进行切割,直至所有的靶位点均发生突变。根据发生的概率,三分之二的基因中的突变是移码突变,而剩余的三分之一的基因缺失或插入一段氨基酸序列,往往也会导致基因功能的丧失。所以使用泰冷二代筛选的细胞群体中目的基因功能被抑制的比例往往大于80%,通常能达到90%以上。

  泰冷二代的优点:1:方便,Cas9稳定株筛选完成后,只要加入gRNA慢病毒,经过1-2周左右的培养即可以获得敲除细胞系;2:高效,Cas9对目的基因的敲除是累积的,所以泰冷二代的敲除效果一般比shRNA的沉默效果好;3:完全敲除,筛选的群体中,有一部分的细胞是完全敲除目的基因的,以该细胞进行功能实验得到的数据会更明显。

 

  Cas9质粒转染-稳定株筛选

  以Lipofectamine 2000为例,进行质粒转染并筛选稳定株:

  1. 准备细胞。细胞的良好状态是筛选实验成功的前提条件。一般的贴壁细胞可以这样处理:选择生长于10cm培养皿处于生长旺盛期的细胞(大部分细胞处于分裂期,细胞汇合率80%~90%),倒掉培养皿内的培养液后加入约5mlPBS清洗残留的培养液,然后加入约2~3ml胰酶消化细胞,镜下观察细胞变圆时弃去胰酶,加入完全培养液(含血清,谷氨酸及双抗)终止消化并吹散细胞至单个。细胞计数板计数,根据计数结果用完全培养基将细胞稀释至3×105个/ml并混匀,将稀释好的细胞分到培养皿内培养,1ml/孔(12孔板)。细胞处理方式及接种密度可以根据细胞的不同加以调整,试剂的说明书提供有部分这方面的信息。

  2. 转染细胞。向一灭菌离心管中加入pCAGGS-Cas9-IRES-HygroR质粒DNA 2μg,补充相应体积的Opti-MEM 至50μl,混合均匀;将Lipofectamine 2000 试剂轻柔摇匀,取2μl在另一管中与48μl Opti-MEM 混合,在室温下温育5 分钟。把稀释后的DNA 与稀释后的Lipofectamine 2000 进行混合,轻轻地混匀,不要振荡。混合后,在室温下温育20 分钟,以便形成DNA 与Lipofectamine 2000 的转染复合物。给待转染的细胞用新鲜的完全培养基换液,将形成的转染复合物滴加到到细胞孔板中,轻轻摇动培养板混匀,将培养板送回培养箱。

  3. 筛选细胞。转染48小时后,将培养基更换为含50μg/ml hygromycin的完全培养基(药物浓度应当通过预实验确定,选择能够使空白细胞死亡的最低浓度),放回细胞培养箱中继续培养。未转染的细胞将在4-14天后开始死亡。通常此时应当给细胞换液,同时保持Hygromycin的浓度。如果此后仍然有显著的细胞死亡,则需要每天换液,直到未转染对照细胞已全部死亡,此时转染组中应当会有部分细胞剩余下来。这个时候换液的间隔可以延长为3-4天换液一次,直到培养板中细胞明显长成克隆或者长满。将长成的细胞传代进入6孔板或是T25培养瓶,以获得足够的细胞用于后续实验。


  gRNA表达病毒感染即敲除稳定株细胞筛选

  1. 准备细胞:

  将Cas9稳定株传入24孔板,可以同时传代原始细胞作为对照。我们的实验中对照gRNA一般靶向敲除eGFP,所以在Cas9稳定株上它能够敲除自身携带的eGFP,而在原始细胞上对照gRNA载体仍然表达荧光。

  2. 病毒感染:

  第二天,加入150μl的病毒液。如果感染效果小于10%,则下次感染时加入5μg/ml的Polybrene。通常感染时间为24小时,如果细胞表现出一定的毒性,可以缩短感染时间至12小时或8小时。

  3. 感染观察:

  感染3-4天后,观察gRNA病毒载体上绿色荧光的表达情况来判断感染比例。

  4. 加药筛选:

  根据预实验,加入通常是2μg/ml的Puromycin的药物浓度。每天观察,根据细胞死亡情况换液,一般第二天就需要换液,每次换液均需要添加Puromycin。一些细胞加药后3-4天,未感染细胞就会被完全杀死,另一些细胞需要更长的时间。

  5. 敲除验证:

  蛋白水平的验证是检验泰冷二代工作效果的理想标准。因为我们通过切割突变来灭活目的基因,其RNA水平的转录可能并不受影响。另一方面,我们当然可以检测gRNA靶向位点的被切割情况,简单的方法可以是在该位点两端设计引物后扩增,然后对扩增片段进行测序,敲除成功的细胞会有特征杂峰。蛋白水平的验证一般在感染后2周开展,对基因组的检测可以在感染后10天开展。

 

CRISPR-Cas9敲除技术

产品名称

产品内容

产品保证

质粒敲除套餐

Cas9+6个敲除靶点质粒

保证至少2个工作

腺病毒敲除套餐

Cas9+6个敲除靶点病毒

保证至少2个工作

腺病毒敲除套餐

Cas9+6个敲除靶点病毒

保证至少2个工作