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药理学病毒

药理遗传学工具介绍

文字:[大][中][小] 2017-1-20    浏览次数:1169    

参考Ying Physiology (2008), Georgia Neuron (2009), Aleena Science (2012), Jurgen Trends in Pharmacological Sciences (2013) & Paul Frontiers in Genetics (2016)


       药理遗传学是指:对一些生物大分子实行改造,使其能和先前无法识别的小分子进行相互作用的过程。而目前主要使用的工具是基于Roth 2007年开发DREADD(Designer Receptor Exclusively Activated by a Designer Drug)技术。


       G蛋白偶联受体(G protein–coupled receptors),它是细胞信号传导中的重要蛋白质,其拓扑构象为7次跨膜的受体。外界刺激诸如光子,神经递质,蛋白质,激素,和其它小分子可以引起GPCR和G蛋白构型变化,影响下游信号通路,包括环磷酸腺苷(cAMP),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),钙离子,小G蛋白,抑制蛋白,各种类型的蛋白激酶,离子通道,以及转录因子等。迄今为止,GPCR的已被确认为在人类基因组中最大的蛋白质家族。目前,GPCR的代表的分子靶标占据批准的药物的50%,并保持用于治疗药物发现最流行的目标。然而,GPCR的极端多样性,它们的组织分布,内源性和外源性配体,和细胞功能以及G蛋白家族的复杂性使得很难在体操纵特定的GPCR的信号传导途径,在体控制特定亚群的细胞就更加困难。此外,许多GPCRs有着共同的结构。因此一种GPCR的配体可能作用于其他GPCR,造成“脱靶”效应。


              


DREADDs


       Roth 等人于2007年开发的DREADD(Designer Receptor Exclusively Activated by a Designer Drug)技术,他们改变了G蛋白偶联受体的化学结构,通过Y3.33C/A5.46G双突变使受体对内源配体失去亲和力,而特异结合人工合成的配体。


       DREADDs表达的空间特异性可以经的立体定位微量注射进特定脑区精确控制目标脑区活性,另一方面,通过基因工程将编码DREADDs的腺相关病毒载体设计为需要Cre重组酶依赖表达,这样结合现在种类繁多的转基因小鼠系,其中的Cre表达被限制在一个特定的细胞类型,依赖于Cre的腺相关病毒就选择性地表达在特定细胞群中。这样,我们就可以在特定脑区的特定神经元亚群表达DREADDs


       DREADDs对内源性配体的亲和力以及活性很低,但可通过合成的化合物被激活。DREADDs被氯氮平N-氧化物(CNO)特异激活。CNO是非典型抗精神病药氯氮平的代谢物,本身不存在与啮齿类动物中,也表现出生物惰性,并缺乏对所有相关天然中枢神经系统的目标明显亲和力(Ki>1mM)。 CNO作用于DREADD表现的效果取决于该DREADD耦合地不同信号级联通路 (联接到信号级联的抑制(GI)或兴奋性(Gq蛋白,GS))。经过修饰的人M4毒蕈碱DREADD,其耦合到GI通路,CNO激活受体后沉默神经元活动(hM4Di受体)。相反地,经过修饰的人M3毒蕈碱DREADD受体,其被耦合到的Gq通路,CNO激活受体引起神经元激活(hM3Dq受体)。

     

       DREADD激活的时间性能取决于它们的激动剂CNO的药代动力学性质。CNO外周给药,30分钟内血浆水平药物浓度达到峰值,在随后的2小时,CNO的血浆水平快速下降。尽管血浆药物浓度时间较短,但是药物导致的行为效果可以持续长达6小时。因此,当需要长时间段(几小时到几天)操控神经元的活动时,DREADD技术是首选;当需要在更短的时间间隔(秒到毫秒)控制神经元活动时,光遗传学是唯一选择。

                   

       DREADD方法在给予CNO方式上也高度灵活。 通常采用的是CNO腹腔注射或者特定脑区注射,也可混入食物或饮用水。通过饮食给药在长期研究中常使用的,尤其是当实验者希望避免重复注入带来的影响,但是饮食给药剂量不能准确控制。至今尚未被广泛使用的一种替代方法是植入的渗透性微型泵。该装置可以在一段长时间内按设计自动释放CNO


       最近,开发出一种新的DREADD-耦合到抑制GI-信号级联改造的kappa阿片受体。此kappa阿片受体DREADD(称为KORD)对内源配体不敏感,包括强啡肽(kappa阿片受体的天然配体)。KORD特异被salvinorin BSALB)激活,SALBalvinorin A的天然精神药物的一种半合成类似物,在不表达KORD的野生型啮齿类动物中本身没有效果。


      具有不同的配体的亲和力的多个DREADDs的存在还允许另一好处:多个DREADDs控制相同的系统。在最近的研究中,兴奋性(hM3Dq)和抑制性(KORDDREADDs用在相同的动物中表达,这种方法允许对同一群神经元活动进行双向控制。重要的是,SALBCNO的药代动力学特征有所不同:SALB控制时间较短(5~60分钟),而CNO控制时间较长(1~6小时)。

    


DREADDsOptogenetics比较


1. DREADDs和光遗传学之间的主要区别是控制神经元的时间尺度。

DREADDs非常适合于在分钟 - 小时的范围内的控制细胞的活性,而光遗传学,可以可逆地操纵以毫秒为单位的范围内的细胞的活性。如果想要在一个极短的时间尺度调节神经元的活动,光遗传学可能是最合适的,如果想要长时间控制(比如在30分钟内),DREADDs可能更理想。


2. DREADDs和光遗传学都具有相对高的空间分辨率,两者可以细胞特异性的表达

我们使用两种病毒时都可以利用立体定位仪注射控制病毒感染的位置。在光遗传学研究中,可以进一步通过控制埋值光纤的位置。在DREADDs实验中,可以通过控制埋值套管位置进行特异脑区给予CNO


3. DREADDs操作上更容易实现。

使用DREADD研究中,CNO途径有相当大的灵活性,并且可以经由几种途径(注射剂,食品,水,或泵)给予CNO。与此相反,光遗传学研究需要专门的仪器来管理激光的开光和强度,一套光遗传行为系统应包括激光器,激光功率测量器,波形控制器,光纤跳线,埋值光纤。尤其在行为学实验中,因为小鼠头部戴有光纤有可能影响小鼠的某些行为(情绪以及运动能力等等)。

 

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