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AAV应用在神经系统的常用方法与注意事项

膜片钳电生理实验验证病毒

文字:[大][中][小] 2017-1-31    浏览次数:853    

       膜片钳技术从早期细胞内记录的基础发展起来,通过使用微电极与细胞膜形成紧密接触,采用cell-attached(细胞贴附式记录模式),电压钳或者电流钳技术对细胞电活动信号进行记录。


Cell-attached模式可以不破膜记录神经元动作电位的发放,是一种接近生理条件的记录方式;


电压钳在紧密封接后破膜,通过钳制细胞膜电压,研究固定电压下细胞电流的改变,可以观察通道打开导致的电流;


电流钳同样在紧密封接后破膜,通过钳制细胞净电流,研究固定净电流下细胞膜电位的改变,可以观察细胞动作电位的发放改变或者膜电位去极化或者超极化。


光遗传病毒的验证通常使用两种模式相互验证:


1. ChR2

       在形成紧密接触后可以通过cell-attached模式,给予蓝色激光,观察蓝光引起的动作电位(如图1A)。在形成全细胞记录后,在电流钳模式(膜电位应在-60m mV,过度去极化应给与外向电流补偿)下,通过给予蓝色激光,可以观察到光诱导的动作电位(如图1B);

图1. A图展示cell-attached模式下记录蓝光引起动作电位发放。图B展示电流钳模式下记录蓝光引起动作电位发放。(病毒信息:Taitool公司AAV-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP, AAV2/9)


       一般使用ChR2等激活类光敏感通道目的是神经环路研究,需要在接受投射的脑区记录神经元(如图2A中记录灰色神经元),通过给予蓝光激活表达在轴突上的ChR2,引起轴突产生动作电位(如图2A中蓝色的轴突),记录突触后兴奋性或者抑制性电流(如图2B)。

 



2. NpHR

       在形成紧密接触后可以通过cell-attached模式,给予黄色激光,可以看到黄光抑制动作电位发放(如图3A)。在形成全细胞记录后,在电流钳模式(可以适当注入电流使产生稳定动作电位),通过给予黄色激光,可以观察到黄光抑制的动作电位,且膜电位超极化(如图3B);(部分数据暂缺)


药遗传病毒验证:


       药理学主要是验证hM3Dq以及hM4Di病毒,一般可以使用cell-attached模式或者全细胞记录电流钳模式。

在cell-attached记录模式下,可以检测到加入CNO(hM3Dq以及hM4Di的特异激活配体)之后,动作电位有明显增加或者减少的趋势。但更严谨的是使用全细胞电流钳记录模式,加入CNO之后,动作电位有明显增加或者减少,同时月可以检测到膜电位有去极化或者超极化的变化趋势(如图4)。


 

图4.A展示了电流钳记录表达hM3Dq的神经元在加入CNO后动作电位发放增加,并且膜电位去极化的现象。B展示了电流钳记录表达hM4Di的神经元在加入CNO后动作电位发放减少,并且膜电位超极化的现象。(病毒信息:Taitool公司AAV-hSyn-hM3Dq-mCitrine&hSyn-hM4Di-mCitirine, AAV2/9)


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