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AAV不同血清型对感染能力的影响

部分AAV可以跨一级突触,关键在于血清型与滴度

文字:[大][中][小] 2017-1-31    浏览次数:725    

文献参考:

Zingg et al., AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors, Neuron (2016)


       AAV病毒作为一种神经系统顺行标记工具被广泛使用,无论是具体实验室还是Allen这样的权威网站也同样使用AAV作为顺行标记一级投射的工具。因为AAV病毒经过设计改造并不能在宿主细胞复制组装,所以通常不认为AAV具有顺行跨突触感染的能力。但是在2016年有研究发现,部分AAV病毒颗粒能够通过从宿主细胞轴突末梢“泄露”的方式,感染下一级神经元,从而产生跨突触感染的现象。


       研究人员发现,向Ai14 mice(Cre依赖的tdTomato敲入鼠)的初级视觉皮层(V1),注射AAV1-hSyn-Cre病毒4周后,V1的下游投射脑区包括上丘(SC)、纹状体(Str)、外侧膝状体腹侧核(LGNv)和脑桥核(PN),除了有红色轴突纤维,还存在红色胞体,而且被标记的下游神经元占对应脑区神经元的比例还比较高。

       而这些脑区并不存在对V1的直接投射,通过同样注射CAV2-Cre这种逆标病毒并没有观察到上述脑区神经元胞体表达荧光的现象,这也排除了是逆行标记的可能。


    

       另外,研究人员也使用同样的策略,向wt小鼠的V1注射AAV1-CAG-GFP病毒,观察那些下游脑区只存在绿色荧光纤维而不存在绿色荧光胞体。

    

       得到这样的结果的原因是因为,这种病毒在轴突末梢“泄露”感染下游神经元的效率较低,所以每个下游神经元被感染的病毒颗粒并不多(与注射位点相比),表达GFP的量并不多,甚至无法达到共聚焦成像要求,所以我们平时无法检测到下游神经元的胞体信号。而在使用Ai14转基因小鼠与Cre病毒时,相当于增加了放大系统。下游神经元被少量病毒感染后,极微量的Cre的活性也可以切割使荧光开启表达,产生可观察的荧光强度。


AAV的血清型与滴度同“泄露”顺行跨突触感染能力密切相关


       研究人员比较了多种血清型,包括AAV1,AAV5,AAV6,AAV8和AAV9,同样使用Cre病毒注射到Ai14 mice V1,检测SC中tdTomato荧光,发现AAV5,AAV6, AAV8没有显现出顺行跨突触特性(排除了Cre“泄露”的可能性),而AAV1和AAV9则有顺行跨突触特性,而且推测AAV1血清型的逆行感染效率更高。

因为AAV跨突触感染的原理是宿主细胞内的病毒颗粒“泄露”,所以要求注射的病毒滴度较高(10e13 v.g./ml),当滴度降低时,这种感染能力也迅速下降。

       AAV跨突触感染在1周就有表现,在2周就达到相对稳定的水平,一直可以稳定持续到3个月之后。


    


顺行感染具有神经元特异性 

       研究人员进一步发现这种顺行感染并不仅仅是轴突末梢释放,被邻近细胞吸收,而是特异感染突触后神经元,不感染同样位置的胶质细胞。


应用——研究环路的新工具

       使用这种AAV顺行跨一级突触标记神经环路的方法,可以用于环路结构与功能的研究,比如传统的示踪研究可以深入研究下游脑区的投射结构,功能研究也可以特异操纵单个下游脑区而不担心动作电位回传或者其他方式影响另外的下游脑区(一对多的环路投射模型)。

    

        例如上图中A为传统环路功能研究,在X脑区注射非选择性ChR2蓝光激活Y1脑区时动作电位可以回传到胞体再传到Y2、Y3,得到的结果不能排除Y2、Y3的影响,而使用AAV顺行感染技术,在X注射AAV1-Cre病毒,在下游Y1注射DIO-ChR2病毒,直接在Y1激活下游胞体并不会影响Y2、Y3,得到的表现就更可能是X-Y1的环路功能。


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