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钙成像病毒

钙成像工具介绍

文字:[大][中][小] 2017-1-20    浏览次数:1312    

参考文献:Lin Nature Methods (2009), Qian Neuron (2012) & Tsai-Wen Nature (2013)


       神经元活动中的钙信号调控是神经生物学研究的重要领域,未来检测神经元内的钙信号变化,科学家发明了荧光钙信号指示剂,现在广泛用于成像的神经活动。传统上使用人工合成的钙染料(Oregon Green Bapta-1, Fluo-4Fluo-3Fura-2等)在使用时可以通过孵育的方式使染料进入细胞。指示剂的乙酰甲酯(AM)衍生物是最常用的活细胞染料形式,AM衍生物能够穿过质膜,随后内源的酯酶切割AM基团,让带电荷的分子困在细胞内。使用钙染料的优点在于操作方便,效果明显,但是缺点就是适用范围只能在离体培养细胞或急性脑片,在体实验需要更生理,更长时间的工具。


GCaMP指示剂的发展

       GCaMP,或者GECIgenetically encoded calcium indicator)。它是一种由GFPcalmodulin(钙调蛋白,CaM)和M13(肌球蛋白轻链激酶肽短)构成的融合蛋白。在细胞内缺少钙离子时,GFP蛋白处于无效构型,而在胞内存在钙离子时,因为CaM与其结合导致CaMM13构象变化,从而使GFP构象发生变化成为有效荧光构型,可以被激发光激活监测。


       然而,早期的GCaMP基础无论是灵敏度和速度都不如传统染料,所以,科学家进一步尝试通过对可能影响灵敏度和速度的氨基酸位点进行突变,试图得到更有效的GCaMP工具。Tsai-Wen Chen (陈摘文)等人通过对cpGFPCaM之间的16个氨基酸的位置进行突变,再将447个突变亚型进行筛选,得到了最新一代的GCaMP6的三种亚型。

 

GCaMP6

       GCaMP6s (slow),6m (medium)6f (fast)分别代表慢,中,快三种动力学性质(动力学越快越适合检测快速变化的钙信号)。相比GCaMP5GGCaMP6的背景荧光水平基本相同,但是在荧光改变能力上提高了1.1-1.6倍。

  

GCaMP6s-荧光该变量最大

对于行动少量电位最敏感的是GCaMP6s,荧光的改变量相比GCaMP3会提高7-10倍,而相比GCaMP5GGCaMP6s对钙离子的亲和力提高了3倍并且具有更高的饱和荧光(比EGFP的荧光还要强27%)。


GCaMP6f-最灵敏

GCaMP6f比GCaMP5G上升时间提高2倍,衰减时间提高1.7倍。所以GCaMP6f是在神经细胞胞浆游离钙最快的基因编码的钙指示剂,它的灵敏度可以媲美OGB1-AM 


AAV-GCaMP6病毒的优势

1.     可以在体观测神经元钙信号活动,这是普通钙染料无法做到的;

2.     可以通过控制病毒滴度以及表达时间调整GCaMP6在脑区的感染率和表达强度;

3.     通过使用特异性启动子(如兴奋性神经元常使用的CaMKllα启动子)特异在兴奋性经元中表达GCaMP6病毒,或者使用DIO-GCaMP6病毒结合特异转基因品系使GCaMP只在某类神经元中表达;


注意事项

       GCaMP应该表达在细胞质内,成环状。如果信号充满整个细胞,包括细胞核,并且荧光很亮,说明表达过量,会影响钙信号的检测,应该降低病毒的滴度(一般在3x10^12 v.g./ml)并缩短病毒的表达时间(21)

 

     


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