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光遗传病毒

光遗传激活工具的比较

文字:[大][中][小] 2017-1-20    浏览次数:1141    

参考Mattis Nature Methods (2012) & Nathan Nature Methods (2014)


  • 1. 分类:

第一类:野生型ChR2以及若干单独氨基酸突变替换的ChR2(H134R)(也称为ChR2R), ChR2(E123A)(也称为ChETAA), ChR2(T159C)(也称为TC), ChR2(E123T/T159C)(也称为ChETATC)和ChR2(L132C)(也称为CatCh);
第二类:由ChR1和ChR2组成的杂合体,包括ChIEF, channelrhodopsin fast receiver(FR)以及channelrhodopsin green receiver(GR);
第三类:由ChR1和VChR1(ChR的突变体)组成的杂合体,所以称为C1V1,也包括突变体C1V1(E162T)(也称为C1V1T)和C1V1(E122T/E162T)(也称为C1V1TT); 

第四类:更加复杂的组合杂合体,例如ReaChR由ChEF/ChIEF,VChR1以及VChR2外加L171I突变组成。

第五类:天然存在的其他光敏感通道,例如CsChR, ShChR(Chronos), CnChR1(Chrimson),和ChrimsonR(K176R)


                                                           



2. 体外光电流比较:


       将不同光遗传激活工具包装到的使用CaMKIIα启动子,融合EYFP荧光基因的慢病毒中,再感染离体培养的海马锥体神经元。通过直接记录被感染的神经元比较不同光遗传激活工具的性质。

                    


激活光谱:

       在电压钳模式记录下,使用恒定1 second, 5 mW/mm2光强,改变光的波长,比较光电流,从而得到不同光遗传激活工具对应的激活光谱;

       我们可以发现几乎所有的最适合波长都在470 nm左右,只有C1V1T以及C1V1TT560 nm左右,另外ChETATC也有一定程度的红移。

                               

       而更新的研究发现,Chronos的激发波长在530 nm左右,Chrimson的最适波长更长,在590 nm左右,ReaChR的最适激发波长在590-630 nm范围。在脑片电生理试验中,使用红外脉冲(735 nm)可以稳定诱导ChrimsonR产生动作电位。

                                     


电流峰值与稳定值比较:

       在同样光照强度条件下,大部分激活工具的电流峰值与ChR2类似(1-1.5 nA),只有ChETAA的电流峰值较小,而C1V1T的峰值较大。

       另一方面,除了电流的峰值,还要关注电流的稳定值。尤其稳定值/峰值的比值反映了长时间光照时能够发挥功能的强弱(一定程度反映了失活情况)。在这方面,ChR2的表现为0.30±0.01,而ChIEF, CatChGR都明显较大。这表明这些工具适合做长时间激活实验。

                               

荧光强度:

       携带有不同激活工具的慢病毒感染后的神经元表达的荧光亮度也不同,其中,ChR2R, ChETAAChETATC的荧光较亮,但是单独荧光亮并不一定能反映出光激活工具表达更多。我们发现稳定状态的光电流/荧光强度的比值中,CatCh, ChIEF, C1V1TC1V1TT都明显较大,说明虽然这些工具对应的荧光总量较低,但是单位荧光对应的电流值较大,从而也印证了这些工具的稳定状态电流值并不低的现象。


给光达到电流峰值的时间:

      达到峰值的时间与通道的失活动力学相关,在使用激活工具实验时,一般使用特定频率激活模式,每次刺激约0.1-10 ms不等,在这个范围内,所有激活工具都没有达到持续模式中最大电流值。所以,脉冲刺激电流峰值对应的时间与脉冲时间正相关 


撤光关闭动力学参数(toff): 

       toff较小说明撤光后光较快,不会在给光结束后持续去极化激活,具有精确操控的潜质。使用3 ms的脉冲给光,我们发现广遗传学激活工具的toff有较大区别。

       比如ChR2大约11.6±0.4 ms,而同样条件,ChETAA只有7.5±0.4 ms,而ChETATC, ChIEF, FR, GR都在10-17 ms,而CatChC1V1T要约60 ms

        

      更新的研究表明,Chronos的toff会更小,而Chrimson略高于ChR2

      


3. 通过急性分离脑片电生理检测光引发动作电位:

 

       主要比较对象是ChR2, ChR2R, TC, ChETAAC, CatCh, ChIEF, FR, C1V1TC1V1TT

在全细胞记录海马锥体神经元,电流钳模式下,通过给予40次不同强度的2 ms的脉冲刺激,我们发现能够诱导动作电位的概率随频率上升而下降,尤其是在40 Hz及以上(与椎体神经元本身性质相关,无法更高频率爆发动作电位)。

 

       在海马椎体神经元中,ChIEF, ChETATCFR都可以正常工作。用ChIEFFR对比CatCh脉冲诱导,与注入脉冲电流作为对照,我们发现,CatCh由于自身撤光关闭动力学时间长,所以在5 Hz脉冲的不给光间隙,膜电位无法恢复,处于较高状态,而更高频率只有第一次脉冲能诱导动作电位,所以这样的工具不适合做脉冲激活实验。ChIEFFR都可以较好的完成2-20 Hz 频率,而在40 Hz时,也与作为注入电流的对照组情况类似,说明这两种工具在这种实验系统是可以正常工作的。


高频激活工具: 

       首先,选用Pvalb-cre小鼠,注射Cre依赖的光激活工具病毒,记录表达银光的快速发放神经元(fast-spiking cells),比较不同工具。现阶段,公认的适合做高频脉冲刺激的激活工具有,ChR2(E123T/H134R)(ChETATR)ChR2(E123A)(ChETAA)CHIEF 

ChETATRChETAA的反应性质基本类似,只是ChETAA诱导动作电位的延迟更短。

                                      

       一般认为神经元膜电位在-70 mV左右,但是高频发放的神经元的膜电位一般会明显去极化,所以通过测定不同膜电位时的撤光动力学参数,可以推测激活工具在高频脉冲是的表现。结果发现无论是ChETAs还是CHIEF都具有类似的性质(ChIEF在极端去极化水平时toff更小)。

                                        

       进一步比较ChETAA与ChIEF的荧光强度,发现ChETAA荧光亮度明显更亮,而ChIEF荧光虽然较弱,但是更多分布在细胞膜上。而比较稳定状态下电流值也类似,说明ChIEF单位荧光对应的激活能力较强。而off大小类似。而两者都可以被20 Hz或者200 Hz脉冲刺激诱导产生对应的动作电位。

        

       在调整光照强度后发现,在低光照强度时,ChIEF比ChETAA诱导动作电位的概率更高,与其一直的是,而在强光照时, ChIEF比ChETAA在单次脉冲诱导多个动作电位的概率更高。


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