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AAV应用在神经系统的常用方法与注意事项

脑定位注射注意事项

文字:[大][中][小] 2016-10-16    浏览次数:1210    

我们以小鼠为例,介绍脑定位注射基本流程与常见问题:


基本流程:


1. 小鼠麻醉:

      常见麻醉手段有三种:异氟烷吸入式麻醉,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉与多成分药物混合腹腔注射麻醉,根据实验需要可以自主选择。吸入式麻醉需要麻醉机控制麻醉剂用量,优点在于麻醉深度可控,手术后可以迅速恢复清醒;戊巴比妥钠腹腔注射麻醉优点在于简单方便,麻醉程度中等,一般可维持1-2小时稳定麻醉;多成分药物混合腹腔注射麻醉优点在于可以深度麻醉,主要用在需要长时间深度稳定麻醉的手术中。


2. 脑定位注射仪使用:

       首先参照脑立体定位图谱或者文献确定脑内注射部位的坐标,包括前囟前或后多少mm,中线左或右多少mm,颅骨下深度为多少mm;

       固定上颌,沿耳道插入耳杆,调节旋钮使头部基本水平;

       剪去头顶部毛,皮肤表面消毒,然后根据需要纵向或者横向剪开皮肤,用棉球和眼科剪刀除去颅骨表面的脑膜,过一会颅骨干燥后找到前囟部位(靠前部的十字交叉点),以前囟部位为原点,进一步通过旋钮调整脑部前后左右水平,然后确定注射位点对应的颅骨位置;

       用颅骨钻在对应部位钻一个小孔,如果出血的话及时止血,然后再参照定位注射坐标把注射电极移动到注射部位,等待5分钟后开始缓慢注入药物,注射后留针15分钟,缝合皮肤恢复。


3. 病毒注射:

      小鼠脑定位病毒注射一般需要使用玻璃注射电极,进口的玻璃电极需要经过电极拉制仪加工,再进过显微镜下修磨后,使开口达到30 μm。根据病毒注射压强原理,注射方法可以分为液压式与气压式两种。


液压式:

      用软管将注射电极,微量进样器和注射泵相连,从微量进样器到电极的内部都充满植物油,不能有空气,通过手动或者自动产生机械正压或负压。当产生负压时,从注射电极前吸入适量病毒(可根据油层与病毒液面观察),再利用正压注射。这种方式的优点在于可以控制病毒体积,例如可以少量注射20 nl病毒,但是缺点在于整个系统不能有空气,如果进入空气,油压不能发挥功能,需要重新排空气。


气压式:

       用软管将注射电极与控制气泵直接相连,从玻璃电极尾部预先用仪器灌注病毒,需要注射时,通过控制脉冲气压开关使病毒注入脑中。优点在于,连接简单,控制方便,但是最少注射的体积一般要大于50 nl。


       不论哪种方法,注射速度都应保持不高于150 nl/minute。在注射玻璃电极定位到预定脑区时,应先等待5分钟等待电极周围脑组织与电极贴紧,再进行注射。在注射结束后,应继续停留在注射位点15分钟再提出,以防向上沿针道扩散。


4. 手术中与术后恢复:

       手术中应使用体温维持仪,另外注意小鼠呼吸,当呼吸频率下降且幅度增加,可能存在阻塞呼吸,或者麻醉过深。手术后需要在电热毯上保持温度,并注射头孢曲松钠等抗生素预防感染。


常见问题:

1. 为什么注射电极堵了,病毒注射不下去,看不到液面下降?

重新用精细镊子修剪电极尖端,但是如果尖端已经过粗,需要使用新电极重新注射。

2. 为什么注射速度过快,没多久就注射结束(常见于气压式)?

需要调整注射参数,比如降低压强,减小气泵开放时间,降低开放频率等。

3. 按照图谱位点注射为什么不准?

因为小鼠年龄,品系,性别以及个体差异的影响,应首先进行预实验,得到初步结果后修改坐标,再进行正式实验。



 
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